El siguiente código creará, a partir de un archivo de forma, un archivo de capa llamado test_A.lyr que tiene una consulta de definición de "testField" = 'A' guardada en él.
import arcpy
arcpy.MakeFeatureLayer_management(r"C:\temp\testLines.shp","test_lyr")
lyr = arcpy.mapping.Layer("test_lyr")
lyr.name = "test"
lyr.definitionQuery = '"testField" = ' + "'A'"
lyr.saveACopy(r"C:\temp\test_A.lyr")
del lyr
Si es necesario, también puede agregar este archivo de capa, o el objeto de capa (lyr) antes de que se guarde como un archivo de capa, en su mapa a través de arcpy.mapping.AddLayer.
Para ver si una cláusula where_clave en MakeFeatureLayer se pasa como una Consulta de definición, que creo que es un comportamiento indocumentado, realicé una segunda prueba a continuación para verificar la Respuesta de @John, y él es bastante correcto.
arcpy.MakeFeatureLayer_management(r"C:\temp\testLines.shp","test_lyr2",'"testField" = ' + "'A'")
lyr2 = arcpy.mapping.Layer("test_lyr2")
lyr2.name = "test2"
lyr2.saveACopy(r"C:\temp\test_2.lyr")
del lyr2
arcpy.mapping.layer()
se ha reemplazado conarcpy.mp.LayerFile()